注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
L-Prolil大鼠前脂肪細(xì)胞*培養(yǎng)基聚乙二單甲 平均分子量1000

Creatine大鼠成骨細(xì)胞*培養(yǎng)基蒽酮 AR

N-Acetyl-L-Valine大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞*培養(yǎng)基N-乙酰-D-半乳糖胺，合 98%

N-Acetyl-DL-tryp tophane大鼠胎兒成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基偶氮二甲酸二異酯 95%

N-Acetyl-glycine大鼠胎兒表皮角質(zhì)形成層細(xì)胞*培養(yǎng)基偶氮二甲酸二叔丁酯 98%

D-Tryptophan methyl ester hydrochloride大鼠成年表皮角質(zhì)形成層細(xì)胞*培養(yǎng)基4,4-二溴聯(lián)苯  98%

L-Cysteine methyl ester hydrochloride大鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞*培養(yǎng)基3'-羥基苯乙酮 98%

D-Phenylalanine methyl ester hydrochloride大鼠皮下脂肪細(xì)胞*培養(yǎng)基硫酸新霉素 USP級(jí),680 I.U./mg

L-Alanine methyl ester hydrochloride大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞*培養(yǎng)基土霉素  97%

D-Alanine Methyl Ester Hydrochloride大鼠表皮黑色素細(xì)胞*培養(yǎng)基異酸苯酯 99%（）

D-Proline methyl ester hydrochloride大鼠腦動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基鄰硝苯 99%

L-Tyrosine methyl ester hydrochloride大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基對硝苯 99%

D-Tyrosine Methyl ester hydrochloride大鼠腦靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基間硝苯 CP

D-Leucine methyl ester hydrochloride大鼠腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基間硝苯 分析標(biāo)準(zhǔn)品

D-Serine methyl ester hydrochloride大鼠腦膜細(xì)胞*培養(yǎng)基間硝苯 standard for GC, ≥99.5% (GC)

D-Valine methyl ester hydrochloride大鼠神經(jīng)元細(xì)胞*培養(yǎng)基間硝苯標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μg/ml，溶劑：甲

氫氯噻（標(biāo)準(zhǔn)品）TNF- Beta(Tumor Necrosis Factor- Beta)  腫瘤壞死因子-β抗原surface layer protein  乳酸細(xì)菌表面蛋白抗體

醋酸TNFAIP1(Tumor necrosis factor-alpha-induced protein 1)  腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白1抗原SUR1  磺酰脲類藥物受體1抗體

醋酸（標(biāo)準(zhǔn)品）Acetylated-P53(Lys382) peptide  抗腫瘤P53抗原SUPT16H/CDC68  染色體特異性轉(zhuǎn)錄延伸因子抗體

鹽酸伊達(dá)比星TP I (topoisomerase I )  拓普西異構(gòu)酶Ⅰ抗原SUMO-1/UBC9  泛素蛋白連接酶E2I抗體

甲磺酸伊馬替尼TOPO II Alpha/DNA TP II Alpha (DNA topoisomerase II Alpha)  DNA拓普西異構(gòu)酶Ⅱ抗原SUMO 1  類泛素蛋白抗體

甲磺酸伊馬替尼（標(biāo)準(zhǔn)品）TPH (Trptophan Hydroxylase)  色氨酸羥化酶(多肽)SULT2A1  膽鹽磺基轉(zhuǎn)移酶

咪喹莫特TRA16 (Testicular orphan nuclear receptor-4 (TR4)-associated protein)  激素受體相關(guān)蛋白/孤兒素受體相關(guān)蛋白(抗原)SULT1E1/Estrogen Sulfotranferase  雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶抗體

咪喹莫特（標(biāo)準(zhǔn)品）TRADD(TNF receptor 1 associated via death domain)  有死亡區(qū)的腫瘤壞死因子受體1相關(guān)蛋白抗原SULT1A1  芳基磺基轉(zhuǎn)移酶1抗體

伊立替康TRAF1  腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1抗原Sulfatase 2  硫酸酯酶2蛋白抗體

伊立替康(標(biāo)準(zhǔn)品)TRAF2/TNF-R2 (TNF receptor-associated factor 2)  腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2抗原Sulfatase 1  硫酸酯酶1抗體
*線蟲通用PCR檢測試劑盒廠家人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽(CCK-8)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT500克

人膽酸(CA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500克

人彈性蛋白(ELN)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1克

人彈性蛋白酶(Elastase)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃100毫克

人蛋白C(ProteinC)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：5克

人蛋白S(ProteinS)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：0.25毫升

人蛋白Z(ProteinZ)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT5克

人蛋白二化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃100毫升
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。