注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Linalool反式 standard for GC正己烷 AR，97%

L-Menthol溴酚紅 AR,80%甲基環(huán)戊烷 Standard for GC

Loliolid考馬斯亮藍(lán)R250 AR甲基環(huán)戊烷 94%

Menthone溴甲酚綠鈉 AR甲基環(huán)戊烷 98%

Mudanpioside C溴甲酚綠鈉 98%,高純級(jí)甲基環(huán)戊烷 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.5% (GC)

Mullilam diol溴甲酚綠鈉 ACS reagent, 90 %2-甲基戊烷 82%

rcantharidin溴甲酚綠鈉 Indicator碳酸鈷(II) CP,Co 43.0 - 47.0 %

Oleuropeic acid 8-O-glucoside鹽酸副品紅(0.2%鹽酸副玫瑰 0.2% 1mol/L,0.2%鹽酸副玫瑰苯胺溶液金屬錳片  99.9% metals basis,不規(guī)則片狀

Oleuropeic acid甲酸丁酯 Standard for GC四氧化三錳 SP

Oxypaeoniflorin溴甲酚紫鈉鹽 AR四氧化三錳 Mn ≥71.0%,  BET surface Area 5～7 m2/g  

Paeoniflorigene溴百里香酚蘭鈉 AR硫酸鎳，七  ACS

Paeoniflorin溴百里酚藍(lán)鈉鹽 ACS4-羥基吡啶 97%

Paeonilactone A2-丁酮 Standard for GC, ≥99.9% (GC)硫代蘋(píng)果酸 98%

Paeonilactone B戊酸丁酯  Standard for GC, ≥99.5% (GC)酸鈉 AR,99.0%

Paeonilactone C正丁 Standard for GC乙鎂 98%

p-Menth-1-ene-3,6-diol溴酚藍(lán)鈉 AR碲化鎘 99.9999%，6N

2,2,3,3,3-五氟-1-VCP (7F3) Rabbit mAbPGAM1/PGAM2  磷酸變位酶1抗體

1,1,2-三氯三氟乙烷（CFC-113）Histone H3 Antibody (ChIP Formulated)PFKL/Fructose 6 Phosphate Kinase  6磷酸果糖激酶抗體

苯胺（標(biāo)準(zhǔn)品）USP4 AntibodyPFKFB2  果糖-2,6-二磷酸酶心肌酶抗體

烯標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)品）Skp2 (D3G5) XP® Rabbit mAbPFKFB1  果糖-2,6-二磷酸酶1抗體

磷酸氫二銨Skp2 (D3G5) XP® Rabbit mAbPFK2/PFKFB3  6磷酸果糖激酶2抗體

Amberlite?IRA402 強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂(氯型)Stat4 (C46B10) Rabbit mAbPescadillo  雌激素受體共調(diào)節(jié)因子抗體

Amberlite XAD-1180N 非離子型多孔樹(shù)脂(粒徑0.350 - 0.600 mm)CD161/KLRB1 (HP-3G10) Mouse mAb (violetFluor™ 450 Conjugate)Persephin  PSP抗體

嘧菌酯（標(biāo)準(zhǔn)品）Ron (C81H9) Rabbit mAbPERP/p53 apoptosis effector related to PMP22  p53凋亡相關(guān)作用蛋白PMP22抗體

雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/ml,u=4%）BCL6 (D4I2V) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)Peroxiredoxin 2/PRXII  硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶Ⅱ/巰基抗氧化蛋白抗體

雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml,u=2%）CK1 AntibodyPerlecan/Heparan Sulfate Proteoglycan 2  硫酸乙酰肝素蛋白多糖2
太米阿米病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)2,3-Dimethyl-4-nitroanisole,95%通用試劑　10G

2,6-Difluoroanisole,98%通用試劑　1G

2,5-Difluoroanisole,98%通用試劑　5G

2,4-Difluoroanisole,99%通用試劑　5G

2-Chloro-5-nitroanisole,98%通用試劑　5G

2-Chloro-5-fluoroanisole,97%通用試劑　5G

2-Chloro-4-fluoroanisole,97%通用試劑　5G

4-Bromo-3-nitroanisole,97%通用試劑　5G

2-Bromo-5-nitroanisole,98%通用試劑　1G

4-Bromo-2,5-difluoroanisole,99%通用試劑　5G

4-Bromo-2-methylanisole,98%通用試劑　5G

2-Bromoethyl ether,90%通用試劑　5ML

2-Bromo-4-fluoroanisole,96%通用試劑　5G

2-Bromo-5-fluoroanisole,99%通用試劑　5G

2,3-Dimethylanisole,97%通用試劑　5G
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。