?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
Tween 20L-羥基脯氨酸 99%秋仙堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99%(HPLC)

Tween 40L-羥脯氨酸甲酯鹽酸鹽 98%秋仙堿 用于植物細(xì)胞培養(yǎng), ≥98% (HPLC)

Tween 60組胺 96%菊苣酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

Tween 65L-高胱氨酸 98%卡拉膠 試劑級(jí)

Tween 80Fmoc-β-Homogln(Trt)-OH 95%雷公藤紅素  98%

Tween 85Fmoc-β-Homomet-OH 97%白屈菜紅堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

Triton x-100Fmoc-L-beta-高苯氨酸 95%（＋）－兒茶素  98%

Triton x-114Fmoc-L-beta-高纈氨酸 97%天然辣椒堿 Nature,≥50% (HPLC)

Triton x-200N-CBZ-羥脯氨酸甲酯 95%硫酸軟骨素（鯊魚） 95%

Triton x-405N(Α)-芐氧羰基-D-組氨酸  98%金雀花堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Brij-35H-His(Trt)-2-Chlorotrityl Resin 0.3~0.8 mmol/g, 100~200 mesh金雀花堿 98%

NP-40Fmoc-His(Trt)-Wang resin 100-200 mesh, 1%DVB咖啡酸 98%

Antifoam OED60KFmoc-D-His(Trt)-Wang resin 100-200 mesh, 1%DVB肉桂 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99.5%（GC)

Antifoam OED24KL-β-高氨酸鹽酸鹽 98%綠原酸 98%

AMEOL-β-高谷氨酸鹽酸鹽 98%蟲草素  98%

GLYMOL-β-高異亮氨酸鹽酸鹽 98%木犀草苷  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

1,4-二乙基苯( PDEB )(GCS, ≥99.5% (GC))FLT3 (8F2) Rabbit mAbMLCK  肌球蛋白輕鏈激酶抗體

鄰二氯苯(Standard for GC,>99.9%(GC))Phospho-FLT3 (Tyr969) (C24D9) Rabbit mAbMLC3F/MYL1/3  肌球蛋白輕鏈1/3抗體

十二烷(Standard for GC,≥99.5% (GC))Clusterin (D7N2K) XP® Rabbit mAbMKRN2/RNF62  環(huán)指蛋白62抗體

1,2-二氯烷(Standard for GC,≥99.5%(GC))Clusterin (D7N2K) XP® Rabbit mAbMKRN1/RNF61  環(huán)指蛋白61抗體

鄰苯二甲酸二乙酯(Standard for GC,≥99.5%(GC))Ajuba (D4D8P) Rabbit mAbMKP-2/DUSP4  絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-2抗體

二異胺(Standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-FLT3 (Tyr589/591) (30D4) Rabbit mAbMKLP1  有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣1抗體

間二氯苯(Standard for GC,>99.5%)Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)Mkl1/MRTF-A  myocardin相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體

鄰苯二甲酸二正辛酯(standard for GC,≥99.0%(GC))Phospho-FLT3 (Tyr591) (54H1) Mouse mAbMKKS/BBS6  巴德-畢德氏綜合征蛋白BBS6抗體

4,4'-二氨基二苯(Standard for GC,≥99.0%(GC))Perilipin-1 (K117) AntibodyMKK7/ERK7  絲裂原活化蛋白激酶MKK7抗體

鄰苯二甲酸二壬酯(standard for GC,≥99.5%(GC))eIF4G2/p97 (D1A10) Rabbit mAbMKK3/MEK3  絲裂原活化蛋白激酶MKK3抗體
亞巴猴腫瘤病毒病毒PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格多聚合苷酸激酶3磷酸化酶抗體3',5,5',7-Tetrahydroxy-4',6-dimethoxyflavone中文名：別名：5,7,3',5'-Tetrahydroxy-6,4'-dimethoxyflavone分子式：C17H14O8

布氏桿菌菌體蛋白抗體Ophiopogonane E中文名：麥冬二氫高異黃酮E別名：分子式：C19H20O7

紅細(xì)胞2,3 - 二磷酸甘油酸合成酶抗體Kumatakenin中文名：華良姜素別名：熊竹素分子式：C17H14O6

骨成型蛋白受體1A抗體Wighteone中文名：懷特酮?jiǎng)e名：Erythrinin B分子式：C20H18O5

Bcl-xL蛋白抗體7,2'-Dihydroxy-5,8-dimethoxyflavane中文名：別名：分子式：C17H16O6